Cara Membuat Media Kultur Jaringan Tanaman
Untuk membuat media kultur jaringan, biasanya menimbang setiap komponen bahan kimia yang terdapat pada resep media dasar. Pembuatan media pada prinsipnya juga dilakukan dengan melarutkan semua komponen media dalam air, sesuai dengan konsentrasinya pada formulasi yang diinginkan. Namun, penimbangan satu per satu komponen media untuk setiap pembuatan media kultur adalah tidak praktis, dan hanya dapat dilakukan jika jumlah zatnya cukup besar untuk ditimbang. Selain itu akan memakan banyak waktu dan mengurangi ketepatan. Kadang-kadang pula timbangan yang dibutuhkan untuk menimbang sejumlah kecil bahan tidak tersedia dalam laboratorium. Kendala ini dapat diatasi dengan membuat larutan stok terlebih dahulu.
Larutan stok adalah larutan yang berisi satu atau labih komponen media yang konsentrasinya lebih tinggi daripada konsentrasi komponen tersebut dalam formulasi media yang akan dibuat. Larutan stok dalam media kultur jaringan dikelompokkan dalam: stok makro, stok mikro, stok Fe, stok vitamin dan stok hormon. Larutan stok bisa dibuat dengan konsentrasi 10, 100, atau bahkan 1000 kali lebih pekat. Larutan stok sebaiknya disimpan dalam ruang gelap dan bersuhu rendah, karena ada beberapa bahan yang tidak tahan suhu tinggi dan cahaya. Stok vitamin tidak dapat dismpan terlalu lama, bisa dibuat untuk digunakan dalam 1 – 2 minggu. Stok hormon dapat disimpan antara 2 – 4 minggu, sedangkan stok hara dapat disimpan 4 – 3 minggu. Larutan stok yang sudah tersimpan lama biasanya mengendap dan ditumbuhi mikroorganisme. Larutan yang sudah terkontaminasi mikroorganisme ini sudah tidak dapat digunakan lagi. Oleh sebab itu kondisi tempat simpan dan wadah larutan harus diusahakan sesteril mungkin. Dengan adanya larutan stok, pembuatan media selanjutnya dilakukan hanya dengan teknik pengenceran dan pencampuran saja.
Jika seluruh larutan stok yang dibutuhkan sudah dibuat, gula dan pemadat medianya ditimbang sesuai kebutuhan, seteleh itu kita dapat meracik dan membuat media.
Sebelum membuat tentunya kita harus mempersiapkan Langkah-langkahnya adalah sebagai berikut :
- Menyiapkan alat-alat dan bahan-bahan yang akan digunakan, yaitu : a) Alat : timbangan analitik, tabung erlenmeyer, gelas ukur, glas piala, pipet, ball pipet, pengaduk kaca, stirer, kompor gas atau hot plate, pH meter atau kertas pH, botol media. b) Bahan: semua komponen media dalam bentuk larutan stok, maupun bahan yang sudah ditimbang seperti gula dan pemadat (agar), plastik tahan panas penutup botol, karet gelang, atau aluminium foil.
- Mencampurkan larutan stok hara makro, mikro, Fe-chelat, vitamin dan hormon sesuai kebutuhan ke dalam erlenmeyer sambil digoyangkan agar larutan dapat homogen.
- Menambahkan gula dalam larutan media tersebut kemudian menera larutan tersebut dengan aquades steril dengan menggunakan gelas ukur sesuai volume media yang dibutuhkan kemudian mengaduknya dengan stirer hingga semua bahan tercampur dengan sempurna
- Melakukan pengukuran pH. (pastikan pH meter sudah dilakibrasi terlebih dahulu). Kadar pH yang dibutukan adalah 5,8. Bila pH masih dibawah 5,8 maka perlu ditambahkan beberapa tetes NaOH atau KOH sampai mencapai kadar pH yang diinginkan ( pH 5,8). Tetapi jika kadar pH terlalu tinggi atau lebih dari 5,8 maka perlu ditambahkan beberapa tetes HCl sampai kadar pH 5,8.
- Memasukkan pemadat media (agar 7gr/L atau gelrite 2gr/L) ke dalam larutan media. Setelah itu media dapat langsung dipanaskan dengan menggunakan hotplate atau dipanaskan di atas kompor gas. Selama pemanasan berlangsung, hendaknya larutan media tersebut diaduk terus-menerus hinga pemadat medianya terlarut seluruhnya. Pemanasan dihentikan sampai larutan terlihat bening dan mulai terlihat gelembung-gelembung udara
- Setelah larut, menuangkan media tersebut ke dalam botol-botol media yang telah dipersiapkan sesuai kebutuhan tergantung besar kecilnya botol. Kemudian menutup botol yang sudah terisi media dengan menggunakan plastik tahan panas atau aluminium foil. Diusahakan supaya botol benar-benar tertutup rapat.
- Memasukkan botol-botol tersebut ke dalam autoclaf dan disterilisasi dengan suhu 121°C dengan tekanan 1,5 kg/cm2 selama 20-30 menit.
- Menyimpan media yang sudah disterilisasi di dalam ruang penyimpanan media ber-AC (suhu 24 - 26°C) selama 3 hari sebelum digunakan untuk memastikan bahwa media tersebut tidak terkontaminasi.
SELAMAT MENCOBA........
sumber tulisan :http://kultur-jaringan.blogspot.com
